פתרון בעיות עבור Gel Electrophoresis

תוֹכֶן

• הוראות
• איך
• שים לב
• מה שאתה צריך

Polyacrylamide ג'ל אלקטרופורזה, או PAGE, היא טכניקה המשמשת ההפרדה של מולקולות אורגניות במדגם ביולוגי. מולקולות של גודל ומשקל קטנים יותר נודדים מהר יותר לתוך ג'ל polyacrylamide כאשר זרם חשמלי מוחל. להקות נפרדות חדה נצפים בדרך כלל לאחר ג'ל הושלמה מודגרת במקום. זוהי שיטה פשוטה יחסית. עם זאת, העדר להקות, להקות מטושטשות או שאינן ברורות עשויות להצביע על בעיה בצעד אחד או יותר של השיטה. אתה צריך לעקוב אחר ההנחיות הבסיסיות כדי לפתור בעיות של שיטת ג'ל אלקטרופורזה שבו התוצאות אינן כצפוי.

הוראות

ג'ל אלקטרופורזה היא שיטה נפוצה להפרדת דגימות חלבון או דנ"א (Jupiterimages / Comstock / Getty Images)

1. להתחיל עם השלב האחרון של ג'ל אלקטרופורזה ולעבוד רטרואקטיבית. עבור ג'ל אלקטרופורזה, השלב האחרון הוא הליך מכתים המשמשים להקות להקות מדגם. כמה בעיות באמת צריך להתרחש במהלך תהליך מכתים. עם זאת, צבע הכתם צריך להיות מומס היטב במאגר המתאים לפני שהוא משמש כתם הג'ל. בדוק כי ריכוז הצבע הנכון שימש.

2. בדוק את מקור המתח. היעדר להקות עשוי להצביע על כך התצורה הנוכחית או מתח גבוה מדי דגימות הבדיקה נודדים מתוך הג'ל. הגדרות גבוהות יכולות גם לגרום לרכיבי מדגם לעבור דרך הג'ל מהר מדי, וכתוצאה מכך רזולוציה גרועה ורצועות לא ברורות. דוגמאות לא יכולות לעבור דרך הג'ל אם תצורת מקור הכוח נמוכה. דוגמאות יכול גם לצבור בבאר שבו הם היו טעון ולא נודדים דרך הג'ל.

3. בדוק את acrylamide נוזלי המשמש להמרת ג'ל polyacrylamide. בדרך כלל, אחוז acrylamide המשמש להמרת טווחי ג'ל polyacrylamide מ 5% ל -15%. דוגמאות המורכבות של מולקולות גדולות נטענים על ג'ל 5% בגלל שברי גדול לנוע לאט יותר בג'ל עם אחוז גבוה יותר של acrylamide. מולקולות קטנות נטענות על גבי אחוז ג'ל גבוה יותר משום ריכוז נמוך של ג'ל לא יוכל לעבד דגימות קטנות יותר.

   
   

4. בדוק ריאגנטים המשמשים לפלמר acrylamide. ג'ל polyacrylamide נוצר על ידי פילמור תערובת נוזלית המורכבת של bis-acrylamide ו acrylamide. אמוניום persulphate ו TEMED מתווספים acrylamide כדי לזרז היווצרות ג 'ל. בדרך כלל, acrylamide צריך להראות סימנים של פילמור (היווצרות ג 'ל) 15 דקות לאחר persulfate אמוניום ו TEMED מתווספים. פילמור המתרחש במהירות רבה הוא תוצאה של כמויות גדולות של persulfate אמוניום. כאשר לא מספיק, זה עלול לגרום פילמור שלם או לא אחיד.

5. לאשר את כמות דגימות טעון. ריכוז מדגם גבוה יכול לנוע לאט דרך הג'ל ולהקטין את רזולוציית הלהקה. ריכוז המדגם נמוך לא ניתן לראות לאחר הג 'ל מוכתם. צבעים אלה מציבים מגבלות על כמות הדגימה המינימלית שניתן לדמיין כתוצאה מרגישות הצבע.

6. לאשר את איכות הדגימות טעון. מלחים ומזהמים אחרים המופיעים במדגם יכולים להשפיע על תנועת המדגם לאורך הג'ל. אלקטרופורזה היא תוצאה של עובר זרם חשמלי באמצעות ג'ל המכיל חיץ מוליך הנוכחי; ריכוז גבוה של מלחים במדגם עשוי להשפיע על התנועה של זרם זה דרך הג'ל. בעת בידוד מדגם, יש לשלב ערכת טיהור כדי לייצר מדגם טהור יחסית.

   
   

7. סקור את הספרות או פרוטוקול כתוב כדי לקבוע אם הנכון "PAGE" שימש לביצוע הניסוי. אחוז acrylamide ב "PAGE" הוא ספציפי לגודל המדגם להיבדק. הספרות יכולה גם לספק מידע ספציפי לגבי הקמת מקור האנרגיה ושיעור ההגירה של המדגם.

איך

• ההנחיות שנקבעו הן כלליות עבור יישומים במחקר ביולוגי.
• בעת פתרון כל הליך מעבדה, עדיף להתחיל עם השלב הסופי ולעבוד רטרואקטיבית על מנת לקבוע את הבעיה.

שים לב

• בעת טיפול acrylamide ו polyacrylamide, ללבוש כפפות. Acrylamide הוא מגיב נוירוטוקסי יכול להיספג דרך העור. Polyacrylamide אינו נוירוטוקסי, עם זאת, הוא מכיל לעתים קרובות acrylamide לא מתוחכם ועדיין עשוי להיחשב רעילים.

מה שאתה צריך

• כיתה של איכות BIS: צלחות אקרילאמיד או צלחות בצורת מראש
• שתי צלחות זכוכית
• Bis-acrylamide
• חיץ TBE (Tris, חומצת בור, EDTA)
• אספקת חשמל
• כובע חדר עליון
• כובע תא תחתון
• DNA חלבון לדוגמא
• TEMED
• אמוניום מפרסמת
• ג'ל לצביעה